作為工程化組織體外構(gòu)建的基石，三維支架在支持細(xì)胞生長并發(fā)育成為具備功能的組織或器官發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。隨著3D 生物打印技術(shù)的飛速發(fā)展，工程化軟組織已朝著結(jié)構(gòu)更復(fù)雜、具有臨床意義尺寸（0.1–10 cm）、更接近生理細(xì)胞密度等方向邁進(jìn)。然而，現(xiàn)有支架難以同時(shí)滿足工程化組織在機(jī)械特性（如結(jié)構(gòu)完整性與穩(wěn)定性）、理化特性（如孔隙率與孔道連通性）以及生物學(xué)特性（如高細(xì)胞密度與活性、血管化能力等）等多方面的需求，對支架的設(shè)計(jì)自由度提出了新的要求。

近日，湖南大學(xué)韓曉筱教授團(tuán)隊(duì)與中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院王維教授團(tuán)隊(duì)在《Nature Communications》期刊上發(fā)表題為“3D triply periodic minimal surface gyroid hydrogel scaffolds for soft tissue engineering"的研究論文。該研究將gyroid結(jié)構(gòu)引入載細(xì)胞軟組織工程，并探索了其在體外構(gòu)建預(yù)血管化組織的能力水平。研究發(fā)現(xiàn)，gyroid具有良好的營養(yǎng)物質(zhì)遞送能力與機(jī)械穩(wěn)定性，不僅支持在整個(gè)3D支架結(jié)構(gòu)內(nèi)部形成致密的微血管網(wǎng)絡(luò)，其連續(xù)高斯曲率還能通過機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的自組裝。此外，在靜態(tài)培養(yǎng)下實(shí)現(xiàn)了HepG2細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的高密度共培養(yǎng)，構(gòu)建出了生理功能仿生的血管化肝腫瘤模型。植入小鼠體內(nèi)后，血管新生能力顯著增強(qiáng)，驅(qū)動(dòng)了腫瘤組織的形成與快速生長。本研究驗(yàn)證了gyroid支架是一種具有生物學(xué)優(yōu)勢的結(jié)構(gòu)，可用于構(gòu)建較大體積的血管化組織結(jié)構(gòu)，對提升軟組織活性體的體內(nèi)外功能具有重要作用。

首先，作者對不同結(jié)構(gòu)參數(shù)下Gyroid結(jié)構(gòu)的比表面積（圖1b）、壁厚（圖1c）、傳質(zhì)性能（圖1g）、細(xì)胞活性（圖1h,i）及力學(xué)性能（圖1j）進(jìn)行了系統(tǒng)表征與分析，篩選出兼具基質(zhì)模量匹配、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、傳質(zhì)效率高效和細(xì)胞活性優(yōu)異的Gyroid結(jié)構(gòu)（相對密度20%，單元尺寸2.5mm）。與具有同等力學(xué)性能的傳統(tǒng)晶格（Lattice）結(jié)構(gòu)相比，該Gyroid結(jié)構(gòu)的傳質(zhì)能力顯著提高（圖1n）。

為驗(yàn)證該Gyroid結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)Lattice結(jié)構(gòu)的血管化能力，作者采用載有1×10? cells/mL HUVEC的GelMA生物墨水制備了兩種結(jié)構(gòu)（圖2b），并在體外培養(yǎng)5天。對兩種支架中HUVEC的活死染色（圖2c）、缺氧情況（圖2d）和細(xì)胞骨架（圖2e）進(jìn)行表征，結(jié)果表明Gyroid中的HUVEC活性更高、缺氧程度更輕、偽足更長。對兩種支架中HUVEC的血管化情況進(jìn)行染色（圖2f）、血管形態(tài)分析（圖2g,h,i,j）、WB（圖2k,l）及q-PCR（圖2m）表征與統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示Gyroid中HUVEC的CD31表達(dá)更為豐富，血管化程度顯著更高。

受天然血管分叉處的雙曲面結(jié)構(gòu)啟發(fā)，作者進(jìn)一步探究了HUVEC對三維曲率的分子響應(yīng)機(jī)制。作者采用載有1×10?cells/mL HUVEC的GelMA生物墨水制備了Gyroid單元結(jié)構(gòu)（Hyperboloidal）及與其同體積、同壁厚的平板結(jié)構(gòu)（Planar）。Hyperboloidal結(jié)構(gòu)中的CD31表達(dá)（圖3c,e）與細(xì)胞細(xì)長比（圖3c,d）顯著高于Planar結(jié)構(gòu)。同時(shí)，通過IF染色（圖3f,g,h,i）與WB（圖3j,k,l）驗(yàn)證了HUVEC通過Integrin β1感知三維曲率，進(jìn)而促進(jìn)YAP入核，最終促進(jìn)了HUVEC的偽足伸展與成管。值得注意的是中尺度下的曲率線索表現(xiàn)出優(yōu)異的成管能力，較高或較低的曲率下成管能力有所下降。

為構(gòu)建血管化肝組織模型，作者將HepG2與HUVEC以4:1的比例混合，采用總細(xì)胞密度為2×10? cells/mL的GelMA生物墨水制備了前述Gyroid與Lattice結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行為期14天的共培養(yǎng)。該結(jié)構(gòu)采用摩方精密面投影微立體光刻（PμSL）3D打印技術(shù)（nanoArch® S140，精度：10 μm），并添加原創(chuàng)光散射抑制劑姜黃鈉（Cur-Na），從而實(shí)現(xiàn)高細(xì)胞密度（2×107 cells/mL）的復(fù)雜曲面高精度制造。活死染色（圖4a,b）與增殖測試（圖4c）表明，Gyroid中的細(xì)胞具有更強(qiáng)的活性與增殖能力。缺氧的IF染色（圖4d,e）與WB（圖4f,g）顯示，Gyroid中的細(xì)胞缺氧水平更低。HepG2與HUVEC的細(xì)胞膜熒光標(biāo)記（圖4h,i）進(jìn)一步表明，Gyroid中兩種細(xì)胞均表現(xiàn)出更強(qiáng)的增殖能力。

為進(jìn)一步驗(yàn)證Gyroid對細(xì)胞功能成熟的促進(jìn)作用，作者首先對HepG2的形態(tài)進(jìn)行表征（圖5a,b），結(jié)果顯示Gyroid中可形成更大的HepG2聚集體。血管化與肝功能的IF染色（圖5c）、ELISA（圖5d）、q-PCR（圖5e）及WB（圖5f,g）結(jié)果表明，Gyroid中的細(xì)胞具有更為成熟的功能表達(dá)。

為驗(yàn)證Gyroid結(jié)構(gòu)所構(gòu)建的體外模型的體內(nèi)促進(jìn)效果，作者將培養(yǎng)至Day 12的模型進(jìn)行皮下移植（圖6a）。經(jīng)過24天的體內(nèi)培養(yǎng)，Gyroid組小鼠的成瘤速度明顯更快（圖6b），最終形成的腫瘤體積更大、血管更為豐富（圖6c,d），而小鼠體重也因腫瘤負(fù)荷增加而相應(yīng)降低。免疫熒光分析（圖6f-j）顯示，Gyroid組腫瘤內(nèi)可灌注血管比例更高、血管數(shù)量更多、面積更大，且無殘留水凝膠，降解成功。

總結(jié)：本研究設(shè)計(jì)的Gyroid水凝膠支架在兼顧力學(xué)穩(wěn)定性與傳質(zhì)效率的同時(shí)，利用其負(fù)高斯曲率作為生物物理信號(hào)，引導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞自組裝形成微血管網(wǎng)絡(luò)。基于該支架構(gòu)建的肝腫瘤模型在靜態(tài)培養(yǎng)條件下形成了更接近體內(nèi)真實(shí)情況的形態(tài)結(jié)構(gòu)。小鼠植入實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Gyroid支架可顯著提高成瘤速度與血管化水平，且無炎癥反應(yīng)，證實(shí)了該支架在體外和體內(nèi)應(yīng)用中均具有良好的適用性。該工作為軟組織工程與血管化組織提供了一種幾何驅(qū)動(dòng)的工程新策略。